Artigo Original
Faria et al.
Exercício agudo melhora a função endotelial
Arq Bras Cardiol. 2017; 108(3):228-236
realizaram o exercício resistido conforme modelo adaptado
de estudos prévios.
12-15
Os ratos vestindo uma jaqueta de
lona puderam regular a girada e a flexão de seus torsos,
tendo sido fixados por um suporte na posição ereta
em seus membros posteriores. Aplicou-se um estímulo
elétrico (20 V por 0,3 segundos e em intervalos de
3 segundos) na cauda do rato através de um eletrodo de
superfície. Como resultado, os animais estenderam suas
pernas repetidamente, levantando a carga no aparelho,
que foi escolhido por imitar os exercícios tradicionais de
agachamento realizados pelo homem, sendo os resultados
obtidos no músculo esquelético do rato similares àqueles
observados no homem.
15
Os ratos se exercitaram no
aparelho por 20 séries de 15 repetições cada. As repetições
foram realizadas em intervalos de 3 segundos com 1 minuto
de descanso entre as séries. A intensidade do exercício
foi de 50% de 1 RM. O grupo controle recebeu o mesmo
estímulo com a mesma frequ ncia e duração, na mesma
intensidade e mesmos intervalos do grupo de exercício.
Entretanto, o aparelho de exercício não teve peso e foi
mantido na posição de repouso. Esses animais, portanto,
não levantaram carga.
Medidas de reatividade vascular
A aorta torácica foi cuidadosamente dissecada, com
eliminação da gordura e do tecido conjuntivo. Para os
experimentos de reatividade, a aorta foi dividida em
segmentos cilíndricos de 3-4 mm. O teste funcional dos
anéis aórticos foi realizado como previamente descrito.
16
Resumidamente, segmentos de aorta torácica de 4 mm
de largura foram montados em câmara de tecido isolada
contendo solução de Krebs–Henseleit (em mM: 118 NaCl;
4,7 KCl; 23 NaHCO
3
; 2,5 CaCl
2
; 1,2 KH
2
PO
4
; 1,2 MgSO
4
;
11 glicose e 0,01 EDTA), gaseificados com mistura contendo
95% O
2
e 5% CO
2
, e mantidos sob uma tensão de repouso de
1 g a 37°C. Registrou‑se a tensão isométrica com um transdutor
isométrico de força (TSD125C, CA, EUA) conectado a um
sistema de aquisição (MP100 Biopac Sistemas, Inc., Santa
Barbara, CA, EUA).
Após 45 minutos de estabilização, todos os anéis
aórticos foram inicialmente expostos por duas vezes a
75 mM KCl, a primeira vez para checar sua integridade
funcional, e a segunda para avaliar a tensão máxima
desenvolvida. Depois, 10 µM de ACT foram usados para
testar a integridade endotelial dos segmentos que haviam
sido previamente contraídos com 1 µM de FEN. A resposta
de relaxamento igual a 90% ou maior foi considerada
como demonstrativa de integridade funcional endotelial.
Após uma lavagem de 45 minutos, determinaram‑se as
curvas concentração–resposta para FEN. Curvas únicas
foram geradas para cada segmento. Investigou-se o
papel de certos vasoativadores locais sobre a resposta
contrátil determinada pela FEN. Os efeitos dos seguintes
fármacos foram avaliados: (1) inibidor não específico da
NOS, N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) (100 µM);
e (2) inibidor não específico da ciclooxigenase (COX),
indometacina (10 µM). Esses fármacos foram adicionados
ao banho 30 minutos antes da produção das curvas
concentração–resposta de FEN.
A influ ncia do endotélio na resposta à FEN na aus ncia
ou presença de exercício foi investigada após sua remoção
mecânica obtida ao se friccionar a luz do vaso com uma
agulha. Confirmou-se a aus ncia de endotélio pela inabilidade
de 10 µM de ACT induzir relaxamento.
Em outro conjunto de experimentos, após estabilização
de 45 minutos, os anéis aórticos dos grupos controle e
de exercício foram pré-contraídos com 1 µM de FEN,
determinando-se as curvas concentração-resposta para
ACT (0,1 nM – 30 mM).
Análise Western blot
Após eutanásia conforme descrição anterior, obteve‑se a
aorta torácica, cujas amostras foram rapidamente congeladas
e mantidas a -80°C para análise das seguintes expressões:
da NOS endotelial (eNOS); da NOS endotelial fosforilada
(p-eNOS); e da NOS induzível (iNOS). De cada artéria
homogeneizada, 80 µg de proteína foram separados por 10%
SDS-PAGE. A proteína foi transferida para membranas de
nitrocelulose, que foram incubadas com tampão bloqueador, e
então incubadas com anticorpos para eNOS, eNOS fosforilada
na posição 1177 do aminoácido serina (p-eNOS1177) (1:250;
BD Transduction Laboratories
TM
, Lexington, UK), e iNOS
(1:250; BD Transduction Laboratories
TM
, Lexington, RU).
Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo
anti-imunoglobulina de camundongo (1:5.000; StressGen,
Victoria, Canadá) conjugado com peroxidase de rábano.
Após lavagem exaustiva, os imunocomplexos foram detectados
com um sistema peroxidase de rábano/quimiluminesc ncia
luminol realçada (ECL Plus, Amersham International, Little
Chalfont, RU) e filme (Hyperfilm ECL International). Os sinais
no ‘
immunoblot
’ foram quantificados com o programa ImageJ,
sendo a mesma membrana usada para determinar a expressão
da
α
-actina com anticorpo monoclonal de camundongo
(1:5.000; Sigma, EUA).
Análise de dados e estatística
A resposta contrátil foi expressa como porcentagem da
resposta máxima induzida por 75 mM KCl. A resposta de
relaxamento à ACT foi expressa como porcentagem do
relaxamento da resposta contrátil máxima. Para cada curva
concentração-resposta, calcularam-se, usando análise de
regressão não linear, o efeito máximo (E
max
) e a concentração
do agonista que produziu 50% da resposta máxima (–log EC
50
).
Assim, a sensibilidade (50% da resposta máxima) do agonista foi
expressa como EC
50
(–log EC
50
), e a máxima resposta contrátil
ao fármaco, como E
max
. O teste
t
de Student não pareado foi
usado para comparar essas variáveis (EC
50
e E
max
) entre os grupos.
Para comparar os efeitos da desnudação endotelial ou
do L-NAME na resposta contrátil à FEN, os resultados foram
expressos como a diferença na área sob a curva concentração-
resposta (dAUC) para os grupos controle e experimental.
Para a expressão proteica, os dados foram expressos como
a razão entre os sinais no
immunoblot
correspondendo à
proteína de interesse e à
α
-actina. As diferenças foram
analisadas usando-se o teste
t
de Student não pareado.
Todos os resultados foram expressos como média ± EP (erro
230
