Artigo Original
Chen et al
Efeitos e mecanismos da DSR na anti-hipertensão
Arq Bras Cardiol. 2017; 108(3):237-245
Western blot
Tecidos congelados foram lisados com tampão de lise celular
contendo inibidor de protease. A concentração proteica de cada
amostra foi medida com base no método de Bradford através do
kit de ensaio proteico Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, EUA) tendo a albumina sérica bovina (ASB) como padrão.
Após procedimento de desnaturação proteica com tampão de
carga, cada amostra (50
μ
g) foi separada emgel de eletroforese em
gel de SDS-poliacrilamida a 8-12% (PAGE) (Bio-Rad Laboratories)
a temperatura ambiente e transferida para uma membrana de
fluoreto de polivinilideno a 4°C. Após bloqueio em leite magro a
5% por 1 hora a temperatura ambiente, a amostra foi incubada
durante a noite a 4°C com anticorpo policlonal de coelho anti-
TH(1:500 Abcam, EUA); anticorpo policlonal de cabra anti-
renalase (1:500, biorbyt, EUA), anticorpo policlonal de cabra anti-
COMT (1:500, LifeSpan BioSciences, EUA); anticorpo policlonal
de coelho anti-TNA (1:500, Abcam, EUA); anticorpo policlonal de
cabra anti-ECA2 (1:200, Santa Cruz, EUA); e anticorpo policlonal
de coelho anti-Mas (1:200, Santa Cruz, EUA), tendo a
β
-actina
(1 : 1000, Abcam, EUA) como controle positivo. Foi adicionado
anticorpo secundário de coelho anti-cabra conjugado com HRP
(1:2000) ou anticorpo de cabra anti-coelho (1:3000) sendo as
membranas então incubadas por 1 hora a temperatura ambiente.
Após lavagem, os sinais foram visualizados por reagentes luminol
(Bio-Rad Laboratories) e a densitometria de cada blot foi analisada
através da versão mais recente do Scion Image 4.0.3.2.
Imuno-histoquímica
O procedimento de marcação foi realizado em cortes de
tecido renal colocado em parafina (5
μ
m). O antígeno foi
recuperado de todos os cortes através de fervura com tampão
de citrato de sódio (pH 6) e incubação com anticorpo policlonal
de coelho anti-TH (1:150, Abcam, EUA); anticorpo policlonal de
cabra anti- renalase (1:150, biorbyt, EUA); anticorpo policlonal de
cabra anti-COMT (1:150, LifeSpan BioSciences, EUA); anticorpo
policlonal de coelho anti-TNA (1:150, Abcam, EUA); anticorpo
policlonal de cabra anti- ECA2 (1:100, Santa Cruz, EUA); e
anticorpo policlonal de coelho anti-Mas (1:100, Santa Cruz, EUA)
durante a noite, a 4°C. Após amarcação, todas as amostras foram
desidratadas e seladas para observação ao microscópio. Foram
observadas a ocorr ncia e distribuição de proteína em cortes de
tecido marcados por anticorpo através do microscópio Nikon
eclipse E400 e da vídeo-câmara digital colorida HyperHAD
(Sony), através do software Easy Image Analysis (NIS-Elements
BR v3.0) para avaliação da imunomarcação.
Análises estatísticas
Os resultados foram expressos como médias ± erro
padrão das médias, e todos os dados passaram por teste
de normalidade. As comparações entre o grupo modelo de
hipertensão e o grupo controle foram feitas através do teste t
de Student não pareado assumindo-se variância desigual, ao
passo que as análises entre 3 grupos foram feitas através do teste
de ANOVA unidirecional com análise post-hoc de Neuman-
Keuls. Foi usado teste t de Student pareado para comparar
antes e depois de se estabelecer o modelo hipertensivo, e antes
e depois de DSR. Foi usada correlação linear para avaliar a
associação entre PAS e o nível dos fatores acima mencionados.
Todos os dados foram analisados por SPSS 22.0. Valores de p
< 0,05 foram considerados significativos.
Resultados
Modelo canino de hipertensão e resposta à DSR
Após 3 meses sob dieta rica em gordura, houve importante
aumento do peso corporal, FC, PAS, PAD e PAM no grupo
hipertenso (*p < 0,05 vs. início, # p < 0,05 vs. grupo controle).
Houve aumento da PAS, PAD e PAM no grupo hipertenso de
aproximadamente 28±10mmHg, 17±8mmHg e 21±8mmHg,
respectivamente, junto a um ganho de peso almejado de
45,2%. Além disso, houve aumento importante de NA
plasmática no grupo hipertenso após 3 meses de dieta rica em
gordura (*p < 0,05 vs. início, # p < 0,05 vs. grupo controle).
(Figura 1). Houve redução importante de aproximadamente
24±9mmHg, 13±6mmHg and 16±7mmHg da PAS, PAD
e PAM, respectivamente, no grupo cirurgia 6 meses após
a cirurgia. Quando comparados com os valores do grupo
cirurgia simulada, a PAS, PAD e PAM do grupo cirurgia também
caíram significativamente (Figura 2A). Seis meses após DSR,
os níveis plasmáticos de NA no grupo cirurgia mostraram-se
significativamente reduzidos (*p<0,05 vs. pré-cirurgia no grupo
cirurgia, # p < 0,05 vs. grupo cirurgia simulada). Além disso, a
NA renal no grupo cirurgia também se mostrou mais baixa do
que no grupo cirurgia simulada (p < 0,05) (Figura 2B).
Níveis renais de TH, renalase, COMT e resposta do TNA à DSR
Seis meses após a cirurgia, a expressão da proteína TH renal
no grupo cirurgia foi menor do que no grupo cirurgia simulada
(p < 0,05). A marcação imuno-histoquímica da TH (marrom)
mostrou-se localizada no citoplasma dos túbulos renais dos
cães beagle (Figura 3A). Os níveis renais de renalase no grupo
cirurgia foram significativamente maiores do que no grupo
cirurgia simulada (p < 0,05). Os resultados imuno-histoquímicos
mostraramque a proteína renalase estava expressa no citoplasma
das células epiteliais do túbulo renal (Figura 3B). A expressão da
proteína COMT renal no grupo cirurgia simulada foi menor do
que no grupo controle (p<0,05). No estudo imuno-histoquímico,
a COMT estava localizada no citoplasma dos túbulos renais dos
cães beagle (Figura 3C). TNA estava localizado no citoplasma dos
túbulos renais dos cães beagle. No entanto, não houve diferença
estatística do TNA renal entre os 3 grupos (Figura 3D).
Níveis renais de ECA2, Ang-(1-7) e resposta do Mas à DSR
O nível de ECA2 mRNA renal e a expressão proteica no
grupo cirurgia foi significativamente maior do que no grupo
cirurgia simulada (p < 0,05). Amarcação imuno-histoquímica da
ECA2 (marrom) estava localizada no citoplasma e na membrana
de túbulos renais dos cães beagle. Seis meses após a cirurgia,
valores com densidade de área positivos no grupo cirurgia foram
significativamente mais fortes do que no grupo simulação (p <
0,05) (Figura 4A). À semelhança da ECA2, a concentração de
Ang-(1-7) no tecido renal no grupo cirurgia simulada foi o mais
baixo, muitomenor do que no grupo cirurgia e no grupo controle
(p<0,005) (Figura 4B). Onível deMas renal também foi mais alto
no grupo cirurgia e no grupo controle do que no grupo cirurgia
simulada. A marcação imuno-histoquímica (marrom) do Mas
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